Диагностические системы

   Современные диагностические системы должны характеризо­ваться следующими качествами: более высокой чувствительнос­тью и, главным образом, специфичностью, а также максимальной автоматизацией и, как следствие, стандартизацией большинства этапов анализа. Не менее важно добиваться уменьшения веро­ятности субъективной оценки результатов и снижения роли че­ловеческого фактора, повышать производительность системы при низкой себестоимости выполнения анализа, сокращать об­щее количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа и компьютеризировать ввод и обработку результатов анализов совместимым программным обеспечением.

  В современной отечественной практике в области сельско­хозяйственного растениеводства, в основном, применяются диагностические системы, не отвечающие вышеизложенным требованиям и основанные на простых иммуноферментных методах анализа. В определенной степени это могло бы быть обусловлено тем, что развитие ПЦР-методов анализа вирусных, грибных, бактериальных и нематодных поражений лимитиру­ется отставанием по секвенированию их геномов. К примеру, из 222 бактериальных геномов, работа над секвенированием ко­торых велась или была закончена к 2003 году, фитопатогенами были менее 14 (Lopez et al., 2003). С другой стороны, в реальном секторе практически полностью отсутствуют лаборатории, ос­нащенные современным оборудованием и квалифицированны­ми кадрами. Исключение составляют лишь некоторые подраз­деления службы карантина растений.

  Говоря о положении в диагностике вирусных фитопатоге­нов картофеля в сегодняшней России в целом, можно упомянуть лишь несколько разработок. Еще в начале 80-х годов прошлого века, в СССР были разработаны ИФА-тесты основных вирусных патогенов картофеля, которые до сих пор производятся на базе ВНИИКХ (Атабеков И. Г., Тальянский, 1997). Довольно качес­твенные моноклональные антитела к ряду вирусов картофеля были получены в ИБХ РАН, однако эти работы не завершились созданием законченных тест-систем.

  Современные методы диагностики вирусных патогенов кар­тофеля, основанные на методе ПЦР, разработаны в конце про­шлого и в начале нынешнего века во многих лабораториях мира, в том числе и в России. Здесь, в частности, хотелось бы отметить разработку системы универсальной ПЦР-диагностики вирусов растений, основанной на их групповой принадлежности (Маагоп, Zavriev, 2002). В настоящее время на нашем рынке наиболее ши­рокий ассортимент диагностических наборов для определения фитопатогенов предлагает ООО «АгроДиагностика». Для диа­гностики вирусных патогенов картофеля этой фирмой освоено производство ПЦР тест-систем в формате электрофореза, FLASH-ПЦР и ПЦР в реальном времени. В настоящее время освоен вы­пуск наборов для диагностики вируса скручивания листьев кар­тофеля, М, S, X, Y и А вирусов картофеля, вируса метельчатости верхушек картофеля и вироида веретеновидности клубней карто­феля.

  К сожалению, в России сегодня использование и внедрение этих разработок даже при тестировании посадочного материала широкого применения пока не нашло. Исключением являются частные компании, в первую очередь производители посадочно­го материала мини-клубней картофеля, например, фирма «Дока», Зеленоград. Как правило, они используют тест-системы запад­ных компаний, в первую очередь фирмы «Agdia» (США) (см. www.agdia.com). Так, «Agdia» предлагает ELISA-тесты к 16 ви­русным патогенам картофеля. Важно отметить, что часть на­иболее экономически значимых тестов предлагается в варианте т. н. стрипов (Рис. XXXIX), где анализ хоть и довольно дорогой (около 10 долларов США за один тест), но настолько прост, что не требует специальной квалификации персонала, занимает око­ло 20 минут и может производиться в полевых условиях. Сре­ди европейских фирм на рынке анализа фитопатогенов следует отметить также фирмы «Adgen» (Великобритания), и «Agritest» (Италия), «Ingenasa», «Plant-Print Diagnostics)) и «Durviz)) (Испа­ния), и «Леве)) (Германия), спектр услуг которых по некоторым патогенам дополняет продукцию «Agdia)>.

  Следует упомянуть и весьма эффективные гибридизационные методы. С помощью этих методов можно не только диагностиро­вать тот или иной патоген, но и получить при необходимости ко­личественную информацию относительно копий анализируемого гена или фитопатогена. В России на основе гибридизационного метода в МГУ им. М. В. Ломоносова была разработана система идентификации вироида веретеновидности клубней картофеля (Атабеков И.Г., Тальянский, 1997). Важно отметить, что в сис­теме использовался не радиоактивный, а флуоресцентный зонд, что делает этот метод безопасным. Похожие методы диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля и других вирои-дов, основанные на радиоактивно-меченных и флуоресцентных зондах, используются в рутинных анализах и за рубежом.

  При диагностике бактериальных инфекций основными оста­ются ИФА-методы. Необходимо отметить, что чувствительность ИФА-методов диагностики бактериальных фитопатогенов даже с использованием моноклональных антител не всегда достаточ­но высока, особенно в случае латентной инфекции. Это обстоя­тельство требует предварительного увеличения количества бак­терий в образце путем их специфической репродукции (Caruso et al, 2002). В каждом конкретном случае необходим подбор оп­тимальных условий репродукции (среды, температура, условия инкубации образцов и т.п.). Во многих случаях существует необ­ходимость тестирования большого числа образцов малоквалифи­цированным персоналом, для чего предложены простые коммер­ческие методы, использующие процедуру иммуноферментного анализа отпечатков образцов растительных тканей на нитроцел­дюлозной мембране (tissue print-ELISA). Специфичность этого метода достаточно высока, однако чувствительность, как пра­вило, недостаточна для достоверной диагностики ряда бактери­альных инфекций. Некоторые специфические задачи решаются с использованием метода проточной фотометрии (Alvarez, 2001). Бактериальные клетки при этом идентифицируются с помощью конъюгатов специфических антител с флуоресцентным красите­лем. Исследование растительных экстрактов этим методом поз­воляет отделять неинфицированные образцы от инфицированных на ранних этапах развития бактериальной инфекции. Существен­ным ограничением использования данного метода в настоящее время является высокая стоимость применяемой аппаратуры.

  На мировом рынке имеются коммерческие диагностические наборы на фитопатогены картофеля, основанные на методе ИФА. Например, фирма «Agdia» предлагает ELISA-тесты к трем пато­генам картофеля бактериального происхождения.

  При диагностировании бактериальных фитопатогенов ме­тодом ПЦР во многих случаях необходимости в их размноже­нии нет. Когда она необходима, следует оптимизировать как этот процесс, так и условия ПЦР-амплификации (Penyalver et al, 2000). Чувствительность диагностики бактериальных фитопато­генов может быть увеличена также путем использования особого варианта ПЦР - т. н. «кооперативной ПЦР» (Olmos et al., 2002). Этот метод был успещно применен для обнаружения возбуди­теля бурой гнили картофеля - бактерии Ralstonia solanacearum в образцах воды. В самое последнее время с целью обнаружения единичных бактериальных клеток в образцах растительных тка­ней используется метод гибридизации in situ с использованием флуоресцентных ДНК-зондов, узнающих видоспецифические участки бактериальных геномов (Volkhard et al., 2000). В России рынок диагностики бактериальных инфекций картофеля методом ПНР представлен наборами, предлагаемыми ООО «АгроДиагнос­тика» для возбудителей кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) и бурой бактериальной гнили картофеля {Ralstonia solanacearum).

  Немаловажными патогенами картофеля являются нематоды, которые поражают практически все виды растений, включая кар­тофель. В связи с тем, что заболевания, вызванные нематодами приводят к очень большим потерям урожаев, мониторинг фитопа-тогенных нематод весьма важен и актуален. В Европе и в России цистообразующие нематоды, поражающие картофель - Globodera rostochiensis и Globodera pallida - имеют статус карантинных па­тогенов.

  В настоящее время обнаружение и идентификация нематод осуществляется как с помощью классических, в первую оче­редь, морфологических, так и современных методов, основанных на ПЦР технологиях (Ibrahim et al., 2001). Наиболее четко и точно видовую идентификацию нематод в современных лабораториях проводят с помощью ПЦР (подробные методические описания можно найти на сайте www.nematode.unl.Edu/nemaid). На рос­сийском рынке на обе вышеупомянутые нематоды имеются ПЦР-диагностические наборы фирмы ООО «АгроДиагностика».

  Другой группой патогенов картофеля, наносящих этой культуре немалый вред, являются инфекции грибной природы. В последние годы наблюдается заметная тенденция и прогресс в использовании молекулярных методов диагностики не только отдельных фитопатогенных грибов, но и в микологии в целом (Atkins, Clark, 2004). Однако, по состоянию на сегодняшний день, диагностических систем для рутинной диагностики фитопатоген­ных грибов, в том числе и карантинных, с использованием ДНК технологий в России не производится. На рынке имеются осно­ванные на ИФА тест-системы фирмы «Agdia» к двум грибным

патогенам картофеля.

  Таким образом, на сегодняшний день ситуацию по рынку диагностики фитопатогенов картофеля можно суммировать следующим образом. В мировой практике диагностика фито­патогенов широко применяются в сельскохозяйственном рас­тениеводстве. При этом имеется целый ряд фирм, в том числе и в России, предлагающих коммерческие диагностические на­боры, подавляющее большинство которых основано на различ­ных модификациях метода ИФА, уступающих по своей чувс­твительности и специфичности методам, основанным на ПЦР. В России рынок ПЦР-диагностики фитопатогенов, в том числе и патогенов картофеля, только создается и пока представлен ООО «АгроДиагностика». С сожалением следует констатиро­вать, что в России использование и широкое внедрение этих разработок в практику сельскохозяйственного производства пока не применяется даже при тестировании посадочного мате­риала, разве что в отдельных частных компаниях, занимающих­ся производством посадочного материала картофеля.