Методы молекулярной диагностики болезней картофеля

  Еще два десятилетия назад методы диагностики инфекций у растений были довольно трудоемкими и занимали много вре­мени. Использование растений-индикаторов для идентификации вирусов, специальных сред для выявления бактерий и другие традиционные методы анализа занимали дни, а, в ряде случаев, недели и месяцы.

  Основной прорыв произощел с внедрением в диагностику метода иммуно-ферментного анализа (ИФА), одним из наиболее распространенных вариантов которого является так называемый ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Ме­тод позволил не только увеличить чувствительность анализа, но и сократить время тестирования до нескольких часов. ELISA и по сей день является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации патогенов. При постановке ИФА тестов используется целый ряд технологий и модификаций с ис­пользованием биотиниликованных и конъюгированных с щелоч­ной фосфатазой или пирофосфотазой антител в так называемых прямом методе, двойном и тройном сандвичах и др.

  Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендо­вала себя в широкомасштабных рутинных тестированиях раститель­ного материала, однако метод обладает не всегда удовлетворительной специфичностью, диагностируя зачастую не отдельные патогены, а целые группы и не позволяет четко идентифицировать конкретные изоляты и штаммы. Следует иметь в виду и тот факт, что от партии к партии качество и специфичность получаемых антител может до­вольно существенно разниться. В настоящее время специфичность ИФА в значительной степени увеличена за счет использования моно-клональных и рекомбинантных антител. Использование модифика­ции метода ИФА - процедуры иммуноферментного анализа отпечат­ков образцов растительных тканей на нитроцелдюлозной мембране (tissue print-ELISA) - также обеспечивает высокую специфичность, хотя чувствительность этого метода недостаточна для использования в случае детекции ряда латентных бактериальных инфекций.

Дрзтим серологическим методом, применяемым для диа­гностики фитопатогенов, в частности бактерий, является метод проточной фотометрии (Alvarez, 2001), хотя высокая стоимость используемой в этой процедуре аппаратуры существенно ограни­чивает его использование в реальной практике.

В настоящее время при анализе растительного материала возникает необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов детекции, позволяющих диагностиро­вать патогены в низкой концентрации, что особенно важно в слу­чае контроля растительного материала на наличие карантинных патогенов. Поэтому в помощь, а сегодня все чаще на смену тра­диционным и серологическим методам, в практику контроля фи-тосанитарного состояния сельскохозяйственных растений и про­дуктов их переработки приходят молекулярные технологии. Это позволяет значительно повышать специфичность анализов и обеспечивать чувствительность, в 10 - 100 раз превышающую чувствительность ИФА.

  Современный метод высокоэффективного тестирования па­тогенов, в том числе и фитопатогенов, основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Bartlett, Stirling, 2003). Простота, высокие чувствительность и специфичность, хорошая воспроизводимость результатов анализов быстро превратили этот подход в один из наиболее перспективных диагностических методов. В отли­чие от традиционных и серологических методов анализа, даю­щих только опосредованное свидетельство наличия инфекции (например, сведения о наличие белков-антигенов диагностируе­мых патогенов), метод ПЦР напрямую доказывает присутствие возбудителя инфекции, специфически выявляя наличие конкрет­ной последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) обнаруживаемого патогена. Кроме того, метод ПЦР, благодаря своей высокой чувствительности, позволяет выявлять единичные копии геномов патогенов, обнаруживая тем самым их наличие тогда, когда другими методами (иммунологическими, бактерио­логическими, микроскопическими) это сделать практически не­возможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто сущест­вующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях: ПЦР-технологии, как правило, позволяют избежать сложностей, свя­занных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Кроме того, использование метода ПЦР позволяет зна­чительно сократить время анализа образца. За счет автоматиза­ции процесс амплификации занимает всего 1 - 2 часа, а с учетом предшествующей пробоподготовки и регистрации результатов анализа, весь процесс занимает не более 4 часов. Помимо всего выше перечисленного, существенным достоинством метода яв­ляется возможность осуществлять количественное определение возбудителя в модификации метода ПЦР в реальном времени.

Высокая чувствительность ПЦР является как преимуществом, так и недостатком метода, создавая ряд проблем, одной из кото­рых является высокая вероятность появления ложноположитель-ных и ложноотрицательных данных. Кроме того, корректность проводимых ПЦР-тестов в значительной степени зависит от адек­ватности методов выделения нуклеиновых кислот из раститель­ного материала; чувствительность детекции зависит от влияния присутствующих в растительном материале ингибиторов ПЦР.

  Все это усложняет процедуру ПЦР-детекции, требуя постановки дополнительных контрольных тестов или использования моди­фикаций метода ПЦР. При молекулярной диагностике фитопато-генных грибов, вирусов и бактерий применяют следующие моди­фикации ПЦР: метод конкурентной ПЦР (Mauchline et al., 2002), кооперативной ПЦР (Co-PCR) (Olmos et al., 2002), ПЦР-гибри-дизация in situ с использованием флуоресцентных зондов (Lopez et al., 2003), мультиплексная ПЦР (Rigotti, Gugerli, 2007), метод множественной (или групповой) мультиплексной ПЦР (multiplex nested RT-PCR) (Morris et al., 2001, Ciapina et al., 2004), метод ПЦР в реальном времени (real-time PCR) (Norman et al, 2002).

  Наиболее перспективным для диагностических лабораторий, проводящих рутинные анализы, являются методы ПЦР в форма­те FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) (Лаптинов, 2004) или в формате реального времени (Norman et al., 2002). Оба формата основаны на флуоресцентной детекции про­дуктов амплификации. Оба формата позволяют регистрировать результаты ПЦР непосредственно во время (ПЦР в формате ре­ального времени) или после проведения реакции (ПЦР в форма­те FLASH), без открывания пробирок, благодаря чему решается проблема контаминации помещения продуктами ПЩ', упроща­ются требования к организации ПЦР-лаборатории, значительно снижается трудоемкость и время проведения стадии детекции. Методы обеспечивают также возможность простой и эффектив­ной документации и хранения результатов ПЦР в компьютерной базе данньгх. Следует отметить, что ПЦР в формате реального времени требует довольно дорогого оборудования, тогда как сто­имость оборудования для ПЦР в формате FLASH сопоставима с оборудованием для гель-электрофореза и в 5 - 8 раз дешевле оборудования для ПЦР в реальном времени.

  Другим примером применения молекулярных методов для диагностики фитопатогенов, основанных на ПЦР и включающих гибридизацию, является весьма перспективный, но пока только развивающийся метод биочипов (Schultz, 1996). Преимущества ис­пользования биочипов состоят в следующем: биочип дает возмож­ность проведения множественного параллельного исследования биологических объектов (тысячи ячеек на 1 см²); он миниатюрен, что обеспечивает удобство эксплуатации, экономию реактивов и т д.; биочип универсален и дешев, так как одна технологическая схема обеспечивает производство различных микрочипов; в био­чипе можно использовать в качестве иммобилизованных зондов

фрагменты ДНК, РНК, белков (с сохранением ферментативных и антигенных свойств), а также клеток - биосенсоров.

  Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что современ­ные, доступные для широкого круга потенциальных потребите­лей технологии диагностики и идентификации фитопатогенов базируются, в основном, на двух технологиях - ИФА и ПЦР, ко­торые постоянно совершенствуются в плане чувствительности, надежности и простоты применения. Кроме того, в настоящее время существует тенденция использования комплекса методов (ring tests), включающих как традиционные (микроскопия, изби­рательные среды, патогенность и т.п.), так и современные серо­логические и молекулярные тесты. Диагностика фитопатогенов, как собственно и любых других объектов, приобретает черты ди­намичной и постоянно эволюционирующей системы.